支原体是一种常见的细胞培养污染物，对科研成果的准确性和可靠性构成威胁。为了有效检测和控制支原体污染，各国药典均对支原体检测方法进行了规定：

　　中国药典2020版

　　<3301>支原体检查法

　　规定：主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查时，应同时进行培养法和指示细胞培养法(DNA染色法)。病毒类疫苗的病毒收获液、原液采用培养法检查支原体;必要时，亦可釆用指示细胞培养法筛选培养基。也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法。

　　欧洲药典EP

　　<2.6.7>Mycoplasmas

　　要求培养法和指示细胞法同时检测，并且更详细的介绍了NAT方法代替前1或2种方法的具体验证要求。直接NAT法可以在有细胞毒性的材料中应用或需要快速方法时使用。细胞培养富集后NAT方法适合于待检样品与指示细胞共培养一段时间后，从细胞和上清中提取核酸，再通过NAT检测。

　　美国药典USP

　　<63>Mycoplasma Tests

　　指出需要用两种方法检测支原体污染：(A)琼脂-肉汤培养法　(B)指示细胞法。并提到经验证的核酸扩增方法(NAT)或酶学方法可以用于检测支原体，但前提是该方法经验证可与培养法和指示细胞法等效。

　　基于以上药典，以下是对应的几种检测方法，为企业提供参考：

　　一、培养法

　　1. 技术优势：经济可靠，适用于最终确认疑似受污染的细胞样本。

　　2. 应用场景：适用于细胞培养实验室和临床治疗细胞的支原体检查。

　　3. 检测要求：

　　使用精氨酸肉汤培养基和支原体琼脂培养基，样品需在2~8°C下储存不超过24小时，或在-20°C下长期保存。此外，每种样品接种6支精氨酸肉汤培养基和3支半流体培养基，并在36°C下培养29天，每隔3天观察一次。

　　4. 结果判断：液体颜色变化(粉色或黄色)或出现絮状沉淀表示支原体生长。

　　二、荧光指示细胞法

　　1. 技术优势：快速简便，适合初步筛查。

　　2. 应用场景：适用于需要快速评估支原体污染情况的场景。

　　3. 检测要求：

　　使用荧光染料(如烟酸己可碱)进行染色，观察染料结合到支原体DNA中的A-T区域，产生特征性的荧光信号。使用荧光显微镜观察荧光小点并记录。

　　5. 结果判断：荧光小点的存在指示支原体污染。

　　三、PCR法

　　1. 技术优势：快速、灵敏、特异性强，适用于精确检测。

　　2. 应用场景：适用于需要高精度检测的实验室。

　　3. 检测要求：

　　使用PCR试剂盒进行扩增，样品需在无菌条件下处理。PCR反应体系需严格控制，而后通过琼脂糖凝胶电泳观察结果。

　　结果判断：明亮条带的位置指示支原体的存在。

　　四、扫描电子显微镜法

　　1. 技术优势：直观准确，适用于最终确认。

　　2. 应用场景：适用于需要进行最终确认的样本。

　　3. 检测要求：

　　使用扫描电子显微镜直接观察细胞中的支原体形态，并对样本进行固定、脱水、干燥和喷金等预处理。

　　支原体感染会使培养细胞慢慢枯萎，因此对培养细胞定期进行支原体检测非常重要。一般来说每1至3个月就应该进行一次支原体检测。将定期支原体检测常规化坚持下去，是细胞培养实验室应对支原体感染的关键。

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